ການວິນິດໄສໂມເລກຸນ, ເຕັກໂນໂລຊີ PCR ທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປແລະຫຼັກການ

PCR, ແມ່ນປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase, ເຊິ່ງຫມາຍເຖິງການເພີ່ມ dNTP, Mg2+, ປັດໃຈການຍືດຕົວແລະປັດໃຈການຂະຫຍາຍການຂະຫຍາຍໄປສູ່ລະບົບພາຍໃຕ້ການ catalysis ຂອງ DNA polymerase, ການນໍາໃຊ້ DNA ຂອງພໍ່ແມ່ເປັນແມ່ແບບແລະ primers ສະເພາະເປັນຈຸດເລີ່ມຕົ້ນຂອງການຂະຫຍາຍ, ໂດຍຜ່ານຂັ້ນຕອນຂອງການ denaturation, annealing, ການຂະຫຍາຍ, ແລະອື່ນໆ, ຂະບວນການຂອງ in vitro replicating ລູກສາວ strand DNA ເສີມກັບແມ່ແບບ DNA strand ພໍ່ແມ່ສາມາດຢ່າງວ່ອງໄວແລະໂດຍສະເພາະຂະຫຍາຍ DNA ເປົ້າຫມາຍໃດໆໃນ vitro.

1. Hot Start PCR

ເວລາເລີ່ມຕົ້ນຂອງການຂະຫຍາຍໃນ PCR ທໍາມະດາບໍ່ແມ່ນການເອົາເຄື່ອງ PCR ເຂົ້າໄປໃນເຄື່ອງ PCR, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໂຄງການຈະເລີ່ມຂະຫຍາຍ.ເມື່ອການຕັ້ງຄ່າລະບົບສໍາເລັດ, ການຂະຫຍາຍເລີ່ມຕົ້ນ, ເຊິ່ງອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ, ແລະ PCR ເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນສາມາດແກ້ໄຂບັນຫານີ້ໄດ້.

PCR ເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນແມ່ນຫຍັງ?ຫຼັງຈາກລະບົບປະຕິກິລິຢາຖືກກະກຽມ, ຕົວແກ້ໄຂ enzyme ຈະຖືກປ່ອຍອອກມາໃນອຸນຫະພູມສູງ (ປົກກະຕິແລ້ວສູງກວ່າ 90 ° C) ໃນໄລຍະການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນເບື້ອງຕົ້ນຂອງປະຕິກິລິຍາຫຼືຂັ້ນຕອນ "ເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນ", ດັ່ງນັ້ນ DNA polymerase ຖືກເປີດໃຊ້.ເວລາ ແລະ ອຸນຫະພູມການເປີດໃຊ້ງານທີ່ແນ່ນອນແມ່ນຂຶ້ນກັບລັກສະນະຂອງ DNA polymerase ແລະຕົວແກ້ໄຂການເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນ.ວິທີການນີ້ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໃຊ້ຕົວດັດແປງເຊັ່ນ: ພູມຕ້ານທານ, ligands affinity, ຫຼືຕົວປັບທາງເຄມີເພື່ອຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາຂອງ DNA polymerase.ນັບຕັ້ງແຕ່ກິດຈະກໍາຂອງ DNA polymerase ຖືກຍັບຍັ້ງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ເຕັກໂນໂລຢີການເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນໄດ້ສະຫນອງຄວາມສະດວກທີ່ຍິ່ງໃຫຍ່ສໍາລັບການກະກຽມລະບົບປະຕິກິລິຍາ PCR ຫຼາຍຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໂດຍບໍ່ມີການເສຍສະລະສະເພາະຂອງຕິກິລິຍາ PCR.

2. RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcription PCR) ແມ່ນເຕັກນິກການທົດລອງສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມຈາກ mRNA ເຂົ້າໄປໃນ cDNA ແລະໃຊ້ມັນເປັນແມ່ແບບສໍາລັບການຂະຫຍາຍ.ຂັ້ນຕອນການທົດລອງແມ່ນເພື່ອສະກັດ RNA ທັງຫມົດໃນເນື້ອເຍື່ອຫຼືຈຸລັງກ່ອນ, ໃຊ້ Oligo (dT) ເປັນ primer, ໃຊ້ reverse transcriptase ເພື່ອສັງເຄາະ cDNA, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຊ້ cDNA ເປັນແມ່ແບບສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບ gene ເປົ້າຫມາຍຫຼືກວດພົບການສະແດງອອກຂອງ gene.

3. fluorescent PCR ປະລິມານ

PCR ປະລິມານ fluorescent (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) ຫມາຍເຖິງວິທີການເພີ່ມກຸ່ມ fluorescent ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ PCR, ການນໍາໃຊ້ການສະສົມຂອງສັນຍານ fluorescent ເພື່ອຕິດຕາມກວດກາຂະບວນການ PCR ທັງຫມົດໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ, ແລະສຸດທ້າຍການນໍາໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານເພື່ອວິເຄາະປະລິມານຂອງແມ່ແບບ.ວິທີການ qPCR ທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປປະກອບມີ SYBR Green I ແລະ TaqMan.

4. Nested PCR

Nested PCR ຫມາຍເຖິງການນໍາໃຊ້ສອງຊຸດຂອງ PCR primers ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ສອງຮອບ, ແລະຜະລິດຕະພັນການຂະຫຍາຍຂອງຮອບທີສອງແມ່ນຊິ້ນສ່ວນ gene ເປົ້າຫມາຍ.

ຖ້າຄວາມບໍ່ກົງກັນຂອງ primers ຄູ່ທໍາອິດ ( primers ຊັ້ນນອກ) ເຮັດໃຫ້ຜະລິດຕະພັນບໍ່ສະເພາະໄດ້ຮັບການຂະຫຍາຍ, ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງພາກພື້ນທີ່ບໍ່ສະເພາະດຽວກັນຈະຖືກຮັບຮູ້ໂດຍ primers ຄູ່ທີສອງແລະການສືບຕໍ່ຂະຫຍາຍແມ່ນຫນ້ອຍຫຼາຍ, ດັ່ງນັ້ນ, ການຂະຫຍາຍໂດຍຄູ່ທີສອງຂອງ primers, ສະເພາະຂອງ PCR ໄດ້ຖືກປັບປຸງ.ປະໂຫຍດອັນຫນຶ່ງຂອງການປະຕິບັດສອງຮອບຂອງ PCR ແມ່ນວ່າມັນຊ່ວຍຂະຫຍາຍຜະລິດຕະພັນທີ່ພຽງພໍຈາກ DNA ເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຈໍາກັດ.

5. Touchdown PCR

Touchdown PCR ແມ່ນວິທີການປັບປຸງຄວາມສະເພາະຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ໂດຍການປັບຕົວກໍານົດການວົງຈອນ PCR.

ໃນ PCR touchdown, ອຸນຫະພູມ annealing ສໍາລັບສອງສາມຮອບທໍາອິດແມ່ນກໍານົດສອງສາມອົງສາຂ້າງເທິງອຸນຫະພູມ annealing ສູງສຸດ (Tm) ຂອງ primers ໄດ້.ອຸນຫະພູມ annealing ສູງຂຶ້ນປະສິດທິຜົນສາມາດຫຼຸດຜ່ອນການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ, ແຕ່ໃນເວລາດຽວກັນ, ອຸນຫະພູມ annealing ສູງຂຶ້ນຈະເຮັດໃຫ້ການແຍກຕົວຂອງ primers ແລະລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດ PCR ຫຼຸດລົງ.ດັ່ງນັ້ນ, ໃນສອງສາມຮອບທໍາອິດ, ອຸນຫະພູມການຫົດຕົວມັກຈະຖືກກໍານົດໃຫ້ຫຼຸດລົງ 1 ° C ຕໍ່ຮອບເພື່ອເພີ່ມເນື້ອໃນຂອງ gene ເປົ້າຫມາຍໃນລະບົບ.ໃນເວລາທີ່ອຸນຫະພູມ annealing ຫຼຸດລົງເປັນອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດ, ອຸນຫະພູມ annealing ໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ສໍາລັບວົງຈອນທີ່ຍັງເຫຼືອ.

6. PCR ໂດຍກົງ

Direct PCR ຫມາຍເຖິງການຂະຫຍາຍ DNA ເປົ້າຫມາຍໂດຍກົງຈາກຕົວຢ່າງໂດຍບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີການແຍກແລະຊໍາລະລ້າງອາຊິດ nucleic.

ມີສອງປະເພດຂອງ PCR ໂດຍກົງ:

ວິທີການໂດຍກົງ: ເອົາຕົວຢ່າງເລັກນ້ອຍແລະເພີ່ມມັນໂດຍກົງໃສ່ PCR Master Mix ສໍາລັບການກໍານົດ PCR;

ວິທີການ cracking: ຫຼັງຈາກເກັບຕົວຢ່າງ, ຕື່ມມັນໃສ່ lysate, lyse ເພື່ອປ່ອຍ genome, ເອົາຈໍານວນຂະຫນາດນ້ອຍຂອງ supernatant lysed ແລະຕື່ມໃສ່ກັບ PCR Master Mix, ປະຕິບັດການກໍານົດ PCR.ວິທີການນີ້ເຮັດໃຫ້ຂະບວນການທົດລອງເຮັດວຽກງ່າຍຂຶ້ນ, ຫຼຸດຜ່ອນເວລາໃນມື, ແລະຫຼີກເວັ້ນການສູນເສຍ DNA ໃນລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນການຊໍາລະລ້າງ.

7. SOE PCR

gene splicing by overlap extension PCR (SOE PCR) ໃຊ້ primers ທີ່ມີສ່ວນທ້າຍທີ່ສົມບູນເພື່ອເຮັດໃຫ້ຜະລິດຕະພັນ PCR ປະກອບເປັນຕ່ອງໂສ້ການຊ້ອນກັນ, ດັ່ງນັ້ນໃນຕິກິຣິຍາ amplification ຕໍ່ມາ, ໂດຍຜ່ານການຂະຫຍາຍຂອງຕ່ອງໂສ້ການຊ້ອນກັນ, ແຫຼ່ງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ A ເຕັກນິກທີ່ fragments amplified overlapped. ແລະ spliced ​​​​ຮ່ວມ​ກັນ.ເຕັກໂນໂລຊີນີ້ປະຈຸບັນມີສອງທິດທາງການນໍາໃຊ້ຕົ້ນຕໍ: ການກໍ່ສ້າງຂອງ genes fusion;gene site-directed mutation.

8. IPCR

Inverse PCR (IPCR) ໃຊ້ primers ດ້ານກົງກັນຂ້າມເພື່ອຂະຫຍາຍຊິ້ນ DNA ນອກເຫນືອຈາກສອງ primers, ແລະຂະຫຍາຍລໍາດັບທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກທັງສອງດ້ານຂອງຊິ້ນ DNA ທີ່ຮູ້ຈັກ.

IPCR ໄດ້ຖືກອອກແບບໃນເບື້ອງຕົ້ນເພື່ອກໍານົດລໍາດັບຂອງພາກພື້ນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ, ແລະສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອສຶກສາລໍາດັບການສົ່ງເສີມ gene;oncogenic chromosomal rearrangements, ເຊັ່ນ gene fusion, translocation ແລະ transposition;ແລະການລວມຕົວຂອງເຊື້ອໄວຣັດ, ຍັງຖືກນໍາໃຊ້ທົ່ວໄປໃນປັດຈຸບັນສໍາລັບການ mutagenesis ໂດຍກົງຈາກເວັບໄຊທ໌, ຄັດລອກ plasmid ດ້ວຍການກາຍພັນທີ່ຕ້ອງການ.

9. dPCR

ດິຈິຕອລ PCR (dPCR) ແມ່ນເຕັກນິກສໍາລັບການກໍານົດປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງຂອງໂມເລກຸນອາຊິດ nucleic.

ປະຈຸບັນມີສາມວິທີການສໍາລັບປະລິມານຂອງໂມເລກຸນອາຊິດ nucleic.Photometry ແມ່ນອີງໃສ່ການດູດຊຶມຂອງໂມເລກຸນອາຊິດ nucleic;real-time fluorescent quantitative PCR (Real Time PCR) ແມ່ນອີງໃສ່ຄ່າ Ct, ແລະຄ່າ Ct ຫມາຍເຖິງຕົວເລກວົງຈອນທີ່ກົງກັບຄ່າ fluorescence ທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້;ດິຈິຕອລ PCR ແມ່ນເທັກໂນໂລຍີ Quantitative ຫລ້າສຸດໂດຍອີງໃສ່ວິທີການ PCR ໂມເລກຸນດຽວສໍາລັບການນັບປະລິມານອາຊິດ nucleic ແມ່ນວິທີການປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງ.