ການນໍາໃຊ້ແລະຂໍ້ຄວນລະວັງຂອງທໍ່ centrifuge ultrafiltration
1) ເລືອກທໍ່ ultrafiltration ທີ່ເຫມາະສົມ.ໃຫ້ສັງເກດວ່າເຍື່ອ UF ແຕກຕ່າງກັນໃນລະດັບຄວາມທົນທານຕໍ່ສານເຄມີຕ່າງໆ.ໂດຍປົກກະຕິ, ທໍ່ ultrafiltration ທີ່ມີການຕັດນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນ 10 kDa ສາມາດເລືອກດ້ວຍການຕັດນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນທີ່ບໍ່ຄວນສູງກວ່າ 1 / 3 ຂອງນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈເຊັ່ນ 35 kDa.ຖ້ານ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈແມ່ນປະມານ 10 kd, ທໍ່ ultrafiltration ທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຕັດອອກຂອງ 3 KD ສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້.
(2) ການກັ່ນຕອງ ultrafiltration, ຊື້ສົດ, ແມ່ນແຫ້ງ, ມີນ້ໍາ ultrapure ຕື່ມກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້ແລະນ້ໍາຫມົດໂດຍຜ່ານເຍື່ອ, ອາບນ້ໍາກ້ອນຫຼືຕູ້ເຢັນ pre cooled ສອງສາມນາທີ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ນ້ໍາແມ່ນ poured ອອກ, ie ທາດໂປຼຕີນຂອງແຫຼວ, ແລະຫຼາຍປານໃດແມ່ນເພີ່ມ, ອັນໃດທີ່ຈະບໍ່ຫຼາຍກ່ວາເສັ້ນສີຂາວຢູ່ດ້ານເທິງຂອງທໍ່.ການດໍາເນີນງານແມ່ນແສງສະຫວ່າງ, ແລະທໍ່ ultrafiltration ຕ້ອງໄດ້ຮັບການ cooled ເທິງກ້ອນກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນ.
3) ທັງມວນ ແລະຈຸດສູນກາງຂອງແຮງໂນ້ມຖ່ວງແມ່ນເພື່ອບັນລຸຄວາມສົມດູນ.ໃຫ້ສັງເກດວ່າຄວາມໄວຂອງການຫມຸນແລະການເລັ່ງບໍ່ໄວຫຼາຍ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນຄວາມເສຍຫາຍໂດຍກົງຂອງເຍື່ອ ultrafiltration.Centrifugal ultrafiltration ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນ (centrifuge precooled ເຖິງ 4 ອົງສາ).ຫຼັງຈາກ RPM ຂອງ centrifuges ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນ g, ມັນແຕກຕ່າງກັນ.ການເລັ່ງຂອງ centrifuge ໄດ້ຖືກປັບເປັນຕໍາ່ສຸດທີ່, ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມກົດດັນໃນເຍື່ອ.ຫມາຍເຫດ, ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າໄດ້ອອກຈາກ centrifuge ຫຼັງຈາກ centrifuge ໄດ້ເຖິງຄວາມໄວປາຍທາງຂອງຕົນ, ຫຼືຖ້າຫາກວ່າທ່ານມີບັນຫາ, ທ່ານບໍ່ສາມາດຈັດການກັບມັນຄັ້ງທໍາອິດ.ທິດທາງຂອງເຍື່ອກັບ spindle ໄດ້ຖືກປັບຕາມຄໍາແນະນໍາ (ກໍລະນີ centrifuge ມຸມແມ່ນເຍື່ອກັບແກນ perpendicular).ໃນການນໍາໃຊ້ພາກປະຕິບັດ, ຄວາມໄວການຫມຸນໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນຕ່ໍາກວ່າໃນຄໍາແນະນໍາ, ດັ່ງນັ້ນຊີວິດຂອງທໍ່ centrifuge ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້.
3) ທັງມວນ ແລະຈຸດສູນກາງຂອງແຮງໂນ້ມຖ່ວງແມ່ນເພື່ອບັນລຸຄວາມສົມດູນ.ໃຫ້ສັງເກດວ່າຄວາມໄວຂອງການຫມຸນແລະການເລັ່ງບໍ່ໄວຫຼາຍ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນຄວາມເສຍຫາຍໂດຍກົງຂອງເຍື່ອ ultrafiltration.Centrifugal ultrafiltration ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນ (centrifuge precooled ເຖິງ 4 ອົງສາ).ຫຼັງຈາກ RPM ຂອງ centrifuges ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນ g, ມັນແຕກຕ່າງກັນ.ການເລັ່ງຂອງ centrifuge ໄດ້ຖືກປັບເປັນຕໍາ່ສຸດທີ່, ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມກົດດັນໃນເຍື່ອ.ຫມາຍເຫດ, ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າໄດ້ອອກຈາກ centrifuge ຫຼັງຈາກ centrifuge ໄດ້ເຖິງຄວາມໄວປາຍທາງຂອງຕົນ, ຫຼືຖ້າຫາກວ່າທ່ານມີບັນຫາ, ທ່ານບໍ່ສາມາດຈັດການກັບມັນຄັ້ງທໍາອິດ.ທິດທາງຂອງເຍື່ອກັບ spindle ໄດ້ຖືກປັບຕາມຄໍາແນະນໍາ (ກໍລະນີ centrifuge ມຸມແມ່ນເຍື່ອກັບແກນ perpendicular).ໃນການນໍາໃຊ້ພາກປະຕິບັດ, ຄວາມໄວການຫມຸນໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນຕ່ໍາກວ່າໃນຄໍາແນະນໍາ, ດັ່ງນັ້ນຊີວິດຂອງທໍ່ centrifuge ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້.
(4) ເມື່ອມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນກັບ 1ml ທີ່ຍັງເຫຼືອ, ເອົາ 50ul ຂອງການແກ້ໄຂ buffer, ເພີ່ມ 10ul ຂອງການໄຫຼຜ່ານແລະເບິ່ງວ່າມີສີຟ້າໃດ, ເປັນການຕັດສິນວ່າທໍ່ ultrafiltration ຂາດທາດໂປຼຕີນ.ຖ້າທໍ່ນັ້ນຮົ່ວ, ຖອກຊັ້ນເທິງຄືນໃຫມ່ແລະໄຫຼຜ່ານທໍ່ໃຫມ່ເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນການກັ່ນຕອງ ultrafiltration.ເພື່ອກໍານົດທີ່ຊັດເຈນວ່າທໍ່ຖືກພາດ, centrifuge ສໍາລັບ 10min ກັບ 5mgml ຂອງ BSA ກ່ອນທີ່ຈະ flowthrough, ແລ່ນໃສ່ກາວທາດໂປຼຕີນ, ຫຼື Bradford crude assay, ແລະສືບຕໍ່ໂດຍການເພີ່ມທາດໂປຼຕີນທີ່ເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ຍັງເຫຼືອ (ເຊິ່ງດໍາເນີນການກ່ຽວກັບກ້ອນແລະປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຈາກຄວາມຮ້ອນ) ຈົນກ່ວາ. ທັງຫມົດຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນໄດ້ຖືກເພີ່ມ.ລະມັດລະວັງໃນລະຫວ່າງການ centrifugation ຖ້າ precipitation ຂອງທາດໂປຼຕີນເກີດຂຶ້ນ, ນໍາໄປສູ່ການປິດທໍ່.ຖ້າເກີດຝົນ, ກໍານົດວ່າສາເຫດສະເພາະຂອງຝົນແມ່ນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນຫຼາຍເກີນໄປຫຼືເປັນສານຕ້ານທານທີ່ບໍ່ເຫມາະສົມ;ອະດີດສາມາດແກ້ໄຂໄດ້ໂດຍການກອງຂອງທໍ່ຫຼາຍ ultrafiltration ພ້ອມກັນ, ຫຼຸດລົງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ, ແລະສຸດທ້າຍໂດຍການແລກປ່ຽນການແກ້ໄຂ buffer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຈົນກ່ວາບໍ່ມີ precipitation ຂອງທາດໂປຼຕີນ.
(4) ເມື່ອມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນກັບ 1ml ທີ່ຍັງເຫຼືອ, ເອົາ 50ul ຂອງການແກ້ໄຂ buffer, ເພີ່ມ 10ul ຂອງການໄຫຼຜ່ານແລະເບິ່ງວ່າມີສີຟ້າໃດ, ເປັນການຕັດສິນວ່າທໍ່ ultrafiltration ຂາດທາດໂປຼຕີນ.ຖ້າທໍ່ນັ້ນຮົ່ວ, ຖອກຊັ້ນເທິງຄືນໃຫມ່ແລະໄຫຼຜ່ານທໍ່ໃຫມ່ເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນການກັ່ນຕອງ ultrafiltration.ເພື່ອກໍານົດທີ່ຊັດເຈນວ່າທໍ່ຖືກພາດ, centrifuge ສໍາລັບ 10min ກັບ 5mgml ຂອງ BSA ກ່ອນທີ່ຈະ flowthrough, ແລ່ນໃສ່ກາວທາດໂປຼຕີນ, ຫຼື Bradford crude assay, ແລະສືບຕໍ່ໂດຍການເພີ່ມທາດໂປຼຕີນທີ່ເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ຍັງເຫຼືອ (ເຊິ່ງດໍາເນີນການກ່ຽວກັບກ້ອນແລະປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຈາກຄວາມຮ້ອນ) ຈົນກ່ວາ. ທັງຫມົດຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນໄດ້ຖືກເພີ່ມ.ລະມັດລະວັງໃນລະຫວ່າງການ centrifugation ຖ້າ precipitation ຂອງທາດໂປຼຕີນເກີດຂຶ້ນ, ນໍາໄປສູ່ການປິດທໍ່.ຖ້າເກີດຝົນ, ກໍານົດວ່າສາເຫດສະເພາະຂອງຝົນແມ່ນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນຫຼາຍເກີນໄປຫຼືເປັນສານຕ້ານທານທີ່ບໍ່ເຫມາະສົມ;ອະດີດສາມາດແກ້ໄຂໄດ້ໂດຍການກອງຂອງທໍ່ຫຼາຍ ultrafiltration ພ້ອມກັນ, ຫຼຸດລົງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ, ແລະສຸດທ້າຍໂດຍການແລກປ່ຽນການແກ້ໄຂ buffer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຈົນກ່ວາບໍ່ມີ precipitation ຂອງທາດໂປຼຕີນ.
(5) ຂັ້ນຕອນທໍາອິດແມ່ນໃຊ້ເພື່ອສຸມໃສ່ທາດໂປຼຕີນ, ແລະຖ້າຈະມີການປ່ຽນແປງ buffer, ຄ່ອຍໆເພີ່ມ buffer ໃຫມ່ (ultrafiltration ຜ່ານເຍື່ອ ultrafiltration 0.22um) ປະມານ 1ml ຂອງທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດ, ແລະ reconcentrate ປະມານ 1ml ສໍາລັບສາມ. ເວລາຕິດຕໍ່ກັນ, ດ້ວຍປະລິມານສຸດທ້າຍທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຕ້ອງການ, ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວບໍ່ເກີນ 500ul, ແຕ່ຍັງຢູ່ໃນ 200ul.ບັນລຸ 1000 × ຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນໃນສາມຄັ້ງ, ການປ່ຽນແປງ buffer ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ຕາມການຄິດໄລ່ຢ່າງຫນ້ອຍ 10 × ຫຼືປະລິມານການເພີ່ມປະລິມານໃນແຕ່ລະຄັ້ງ.
(5) ຂັ້ນຕອນທໍາອິດແມ່ນໃຊ້ເພື່ອສຸມໃສ່ທາດໂປຼຕີນ, ແລະຖ້າຈະມີການປ່ຽນແປງ buffer, ຄ່ອຍໆເພີ່ມ buffer ໃຫມ່ (ultrafiltration ຜ່ານເຍື່ອ ultrafiltration 0.22um) ປະມານ 1ml ຂອງທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດ, ແລະ reconcentrate ປະມານ 1ml ສໍາລັບສາມ. ເວລາຕິດຕໍ່ກັນ, ດ້ວຍປະລິມານສຸດທ້າຍທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຕ້ອງການ, ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວບໍ່ເກີນ 500ul, ແຕ່ຍັງຢູ່ໃນ 200ul.ບັນລຸ 1000 × ຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນໃນສາມຄັ້ງ, ການປ່ຽນແປງ buffer ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ຕາມການຄິດໄລ່ຢ່າງຫນ້ອຍ 10 × ຫຼືປະລິມານການເພີ່ມປະລິມານໃນແຕ່ລະຄັ້ງ.
ເວລາປະກາດ: 09-09-2022